海浜部や浅海域に生息する海草・マングローブ等の海生植物が生産する炭素はブルーカーボンと呼ばれ、気候変動緩和への貢献の観点から注目されている。本稿では、ブルーカーボンが外洋に流出したあとに長期貯留されていることを実証するための環境DNA技術の応用について紹介する。

はじめに

　ブルーカーボンとはアマモ場（海草藻場）、マングローブ、塩性湿地、大型藻類群落などの海浜部・浅海域に生育する大型植物が作る生態系で生産される有機炭素のことを意味する。生産された有機炭素の一部が堆積物中や深海底などに運ばれて長期的に残留すると、効果としては大気中の二酸化炭素を捕獲して長期にわたって隔離することになるので、二酸化炭素に起因する気候変動の緩和に貢献することが期待されている。このため気候変動緩和の目的でマングローブや藻場を保全・造成する事業が行われており、また期待される新規炭素貯留量を根拠とする炭素クレジットの取引も行われるようになっている。しかしブルーカーボンが堆積物や深海底などの長期貯留リザーバに実際に移行していることを直接的に証明することは技術的になかなか難しい。現在、ブルーカーボンによる二酸化炭素吸収への貢献としてインベントリに計上されている値には、これらの植物群落の現存量または生産量の実測値に長期貯留への転換効率として或る係数を乗じて得られる期待値が使われている。ここで用いられている係数は科学的根拠のあるものではあるが、実証データの不足がブルーカーボンの意義やクレジットの根拠に対して幾分か疑義を生じさせる結果になっていることは否定できない。

　海洋の長期貯留リザーバにブルーカーボンが含まれていることを実証するためには、堆積物や深海底に貯留されている有機炭素の生成起源を解明して、その起源の中に藻場やマングローブの植物が含まれていることを証明しなければならない。こうした起源解析のために一般的に用いられる信頼性の高い指標としては安定同位体比があり、ブルーカーボン研究においても不可欠なツールとなっている。特に炭素安定同位体比は、それをになう物質が食物網や続成作用を経て別の物質に変化した場合でも概ね同じ値に維持されるという、トレーサーとして優れた特長を持つ。しかし長期貯留炭素の起源評価に適用される場合、安定同位体比に特有の起源物質に対する分解能の低さや寄与率の小さいソースに対する感度の低さが弱点となるため、確実な起源の特定と実証を行うには安定同位体比以外の起源指標を併用することが必要とされている。

　こうした目的にかなう起源指標として最近注目を集めているのが環境DNAである。すなわち海洋の長期貯留リザーバに残る、有機炭素の起源となった生物のDNAの痕跡をたどることによって、そのリザーバの形成にブルーカーボンが寄与していることを実証する試みである。環境DNAとは、そのDNAを作った生物の体から外に出て環境中に残留している、解読可能な配列を持つ細胞外DNA分子のことである。環境DNAの研究は、DNA情報を使って海洋や土壌中に生息する微生物の群集組成を網羅的に解析するために開発された分析技術を、細胞外DNAの解析に応用するところから始まった。たとえば土壌の中に残留している植物の細胞外DNAの情報を読み取ることにより、過去にその場所で植生を形成していた植物の種類を推定するような使い方が行われた（→参考文献）。その一方で、海洋堆積物にはDNAが豊富に含まれていることが以前から知られており、DNA分子にはリンが多量に含まれることから、リンの生物化学的循環の観点からも注目されてきた。近年のDNA解析技術の進歩に伴って海洋堆積物中のDNAに関しても塩基配列の解読が可能であることが明らかとなって以降、DNA分子が堆積物中で配列を保ったまま長期にわたって分解されずに保持されるメカニズムや、細胞外DNAがバクテリアの形質転換を通して微生物の進化を駆動している可能性に研究の関心が広がった。こうした知見を背景としつつ、海洋堆積物中の多量のDNAの中にブルーカーボン由来と特定できるDNA分子が残留していれば、それを根拠として長期貯留されているブルーカーボンの存在を実証できるのではないかという期待がもたれるようになったのである。

　現在は、環境DNAをいわば動物の足あととして利用する機会が多くなっている(→関連サイト）。たとえば魚は体表からたえず少量のDNAを放出して周囲の水中に残しているが、このようなDNA分子は脆弱であって、通常は数日の間に分解されて消失する。この性質を利用すると、環境水中に残された魚のDNAを調べることで直近での魚類の分布や行動に関する情報が得られることになる。このため最近は環境DNAといえばこのような一時的に環境に漂流している短命のDNA分子を指すという理解が定着しつつあるが、本稿で取り扱う環境DNAはこれとは異なる実体をもつものである。

ブルーカーボン研究における環境ＤＮＡの利用

　海洋堆積物や海水中の浮遊物質、沈降粒子等から、その中に含まれる環境DNA情報を取得するために一般的に用いられる手順を図１に示した。野外試料から抽出・精製を経てDNAの粗抽出液を得たあと（①〜②）、その中に含まれるDNA配列の網羅的な解析を目指すメタバーコーディング法と、特定のDNA配列の定量を目指す定量的リアルタイムPCR法（qPCR）の二つの流れに分かれることになる（③〜⑤）。この手順自体は、前項で述べた微生物群集組成の解明を目的とする場合でも、また動物の分布と行動の追跡を目的とする場合でもほぼ同様である。この方法を海産植物に適用する場合に特有の技術的工夫、制約、注意点に関しては、最近優れた総説が公表されている（→参考文献）。

　手順の最初のステップとして、天然試料からDNAを抽出するためにどのような手法を選択するかは、最終的に得られるデータの意義や解釈を左右する重要な要素である。特に堆積物試料からのDNA抽出方法の選び方に関してはLeverらによる詳細な研究があるので、それを参照していただきたい（→参照）。ただし現在では、図１の②の部分を一連の手続として扱う優れた試薬キットが土壌・植物・生物組織等の対象別に製造・市販されており、データの品質管理や相互比較を容易にする意味で、信頼できる普及度の高いキットを手順書通りに使用するのが現実的な選択肢となっている。

　海産植物に対する環境DNAの適用の歴史は比較的新しく、ブルーカーボンという概念が提唱された2009年以降に本格的な取り組みが始められた。図１に示した二つの方法では、メタバーコーディング法の方が複雑で高度な解析のように思えるが、実際にはqPCR法を実施するためには目的の種や系統群に適合する特異的プライマーを独自に設計する必要があることから技術的に難易度が高く、これまでの海産植物に対する適用例ではメタバーコーディング法の方が主流となっている。

メタバーコーディング法の適用例

　メタバーコーディング法を環境試料からの海産植物由来DNAの検出に使用する上で、まず注意しなければならない点は、図１③においてアンプリコンを生成するために用いられるPCRプライマーの選択である。メタバーコーディング法ではなるべく広い範囲の対象種のDNAを均等に増幅できるプライマーを選ぶ必要がある。海産植物を対象とする研究でこれまでに用いられているのは、葉緑体DNAに含まれるrbcLと呼ばれる遺伝子領域を増幅できるプライマー（→文献）、および真核細胞の18S rRNAを生成する核DNAに含まれる遺伝子の中で種特異性が高い領域（V7またはV9領域）に対応するプライマーである（→文献1, 2, 3, 4）。Ortegaらは海産植物のDNAの検出・同定に適用できる可能性がある18種類のプライマーが比較検討されており、調べられている範囲内では18S rRNAの可変領域に対応するプライマーが最も適応範囲が広いと結論されている。

　Reefらの研究では、オーストラリア東岸の海草藻場の表層堆積物から、海草・マングローブ・塩性湿地植物・陸上植物のDNAを検出することに成功している。rbcLは光合成生物一般に含まれる遺伝子であるが、この研究で使用されているプライマーでは維管束植物のDNAしか増幅することができなかったため、大型藻類については調査対象外となっている。文献1, 2, 3, 4の研究では、この制約を回避するため18S rRNAの遺伝子領域に基づくプライマーが用いられ、実際に大型藻類のDNAを成功裡に検出している。ただし18S rRNAの配列に基づくプライマーでは原理的には全ての真核生物のDNAが増幅されてしまうため、得られるアンプリコンの中に占める海産植物由来のDNA配列の割合は10%以下になってしまうことが多い（→文献）。これらの研究例では、安定同位体比のデータにベイズ統計モデルを適用した堆積物有機炭素の起源解析が併せて用いられている。そして環境DNA解析の結果から示唆される主要な起源植物と、安定同位体比からの起源推定結果との間に概ね整合性があることから、環境DNAが示唆する海草や大型藻類が実際に堆積物の炭素貯留に貢献している可能性が高いと考察されている。

　しかしながら大型藻類を対象とする場合、図１⑤において必要になる大型藻類の参照配列ライブラリが現段階では一般にかなり貧弱であることがDNA検出・同定に対する深刻な制約条件となっている。このため例えば前出の研究では、英国沿岸のコンブ場の沖合にある表層堆積物からコンブを中心とする大型藻類のDNAを検出することに成功しているが、そのために分類群の同定のためのDNA配列相同性の基準値を80%とかなり緩く設定している。また別の例では外洋域の海水中の懸濁態有機物から大型藻類由来のDNAを検出することが試みられ、外洋海水中には紅藻類のDNAが圧倒的に多く含まれるというやや奇異に感じられる結果を報告している。このような結果になった原因の一つとして、配列の同定のために使用した参照ライブラリ自体に含まれる情報の偏りがあることを著者は指摘している。使用されたプライマーの選択性が問題になることもある。例えばArinaらの研究では藻場堆積物の炭素貯留に寄与している大型藻類種を明らかにしているが、現場ではふつうに見られる褐藻種であるラッパモクの一種がメタバーコーディング法では全く検出できなかった事実に注意を促している。

　メタバーコーディング法に付随する問題はまだ他にもある。第一に、環境DNA試料は既に断片化が進んだDNAを多量に含むと予想されるため、断片化したDNAからでも情報を検出できるように100塩基対前後の短いバーコード領域が使われていることが挙げられる。このためにDNA配列からの種同定の解像度は低くなり、一つのバーコードが複数の現生種に対応づけられる場合も多い。第二に、メタバーコーディング法では当初のDNA抽出液をテンプレートとしてPCRで増幅されたアンプリコンを母集団として解析されるが（図１④）、PCR法は増幅対象のDNAに対して完全に非特異的なわけではなく或る程度の選択性と誤差を必ず含んでいるため（→文献）、解析対象のアンプリコンが原試料のDNA組成を必ずしも正確に反映しているわけではない。第三に、次項で例示するように、植物の組織重量あたりに含まれるDNAのコピー数は、或る程度分解の進んだ植物体では新鮮な植物体に比べて著しく小さくなる。このため、堆積物のように分解の進んだ植物体に由来する有機物が主成分である試料に、たまたま生体から離脱したばかりの新鮮な植物体断片がわずかに混入していると、解析対象のアンプリコンの中ではごく少量の新鮮な植物体に由来するDNAが全体の大部分を占め、解析結果に大きなバイアスを与えてしまうことになる。

　このような多岐にわたる問題を含むため、現段階ではメタバーコーディング法による環境DNAの解析結果をブルーカーボンの長期貯留に対する定量的な実証データとして使用することには難があり、参照データベースの充実と更なる方法論的革新が必要とされている。

リアルタイムＰＣＲ法の適用例

　私共の研究グループでは、環境DNA技術を起源植物別の炭素貯留量の定量化に利用することを目標として、リアルタイムPCR法（qPCR）を応用した研究を進めてきた。qPCRでは図１に示されているように試料からのDNA抽出液を直接の定量対象として扱うため、定量性の点ではアンプリコンに依存するメタバーコーディング法よりも格段に優れている。この方法では海産植物のうちの特定の種または特定の分類群に属する種のDNAのみを定量対象とするため、その種や分類群に特異的なプライマーを設計した上で、研究対象となる海域に出現する可能性のある近縁種や近縁の系統群に属する植物のDNAに対してはそのプライマーが反応しないことをあらかじめ検証しなければならない。このために実際にどれほど多くの作業が必要になるのかについては、例えばHamaguchiらの論文の研究方法の項が参考になると思われる。

　qPCRによる増幅対象となるDNAの部位としては、アマモのような維管束植物に対しては核DNAに含まれる種特異性が極めて高いInternal Transcribed Spacer (ITS)と呼ばれる領域、または葉緑体DNAに含まれるmatKという遺伝子をコードする領域が用いられている（文献11, 12）。大型藻類が対象となる場合はITS領域が主に用いられ、補助的にミトコンドリアDNAに含まれるCOIという遺伝子をコードする領域が用いられる（文献11）。qPCRを用いて特定のDNAの濃度を定量する場合の検出限界・定量限界については文献11で論じられている。開発・検証されたこれらのプライマーを利用して、私共はこれまでに瀬戸内海の堆積物から沿岸に生息するアマモのDNAを（文献12）、広島湾の堆積物から大型褐藻類と緑藻類のDNAを（→文献1, 2）、また八重山諸島沖の外洋性堆積物から亜熱帯性海草類とマングローブのDNAを（図２、→文献）、それぞれ定量的に検出することに成功している。私共はまた他の日本周辺海域でも同様の調査を継続しており、遠洋域でも海底谷や海盆のような堆積性の地形環境では多くの場合に堆積物中から海草や大型藻類に由来するDNAを微量ながらも定量的に検出できることを確認している。これらの成果は、海浜部で作られるブルーカーボンが実際に沖合・外洋に流出して、予想外に広い範囲の海底に到達して堆積物中に貯留されていることを実証するものである。

　qPCR法はダイナミック・レンジが広く検出感度が極めて高いため、ごく古い時代の試料からも対象のDNAを検出できる可能性がある。図３は瀬戸内海のアマモ場で得た長さ2 mの堆積物コア試料に対してqPCRによるアマモDNAの定量（ITS配列に基づく）と放射炭素年代測定を行った結果である（→文献）。これによると4000年以上前の堆積層からでもアマモDNAが定量可能な水準で検出できていることが分かる。ただしDNAの濃度は表層に比べて1000分の1ほどに減少していた。同じコアの全有機炭素濃度と、炭素安定同位体比から推定されるアマモ由来有機炭素の濃度も深度と共に減少していたものの、その減り方はアマモ由来DNAの減少速度と比べるとはるかに緩やかであり、アマモ由来の単位DNA数あたりの有機炭素量（OC/DNA比）はコアの1 m以深では表層に比べて約100倍にまで上昇していた（図３）。このように、DNAは植物体全体の平均に比べると速やかに分解されてしまう傾向があるものの、ごく一部は数千年にわたって解読可能な状態を維持することが分かる。これほど長期にわたってDNAが保存される条件は解明されていないが、堆積物中は比較的低温であること、無酸素であることに加え、DNA分子が堆積物の鉱物粒子等の固体表面に物理的に吸着することで微生物の酵素による分解を免れることができることが重要な要因であると考えられている（→文献）。

　図４は、植物体に含まれるDNAが植物体全体の平均に比べて速やかに分解されることを証明した実験結果の一例である（未発表）。ここでは暖海性の海域の普通種である褐藻のヒイラギモクの葉状体を、小さく切って断片としてナイロンメッシュのバッグに密封し、そのまま天然海水の流水中に置いて暗所で１年間にわたり微生物分解させた。藻体重量とDNA量はいずれも経過日数に対し指数関数的に減少したが、その時定数は前者が約30日なのに対して後者が約1.7日であり、DNAは藻体全体に比べて20倍近くも速く分解されていたことが分かる。DNAは分解初期の１週間でほとんど消失してしまうものの、ごく少量が残留し、OC/DNA比は３ヶ月後以降はほぼ一定となって推移した。海草のスガモを使って行った実験でもほぼ同様の結果になったが、１年後のDNAの残留率はスガモの方がヒイラギモクよりもおよそ10倍高くなっていた。DNAが長期にわたって解読可能な状態で残留するメカニズムは未解明であるが、植物体に由来する何らかの難分解性で難溶性の有機物ポリマーの中に埋め込まれた状態、またはその表面に吸着した状態でDNA分子が保存されているものと推察される。

　図３と図４の結果を総合すると、①植物体に含まれるDNA分子は植物体そのものよりもはるかに速く分解されて解読不能となる、②しかし完全に消失するわけではなく、残存している植物由来デトリタスに対してほぼ一定した存在比のDNAが長期間（条件によっては数千年以上）にわたって残留する、③これらの分解速度と残留率は植物の種類によって大きく異なりうる、という結論が導かれる。分解が進んだ状態でのOC/DNA比の種特異性と長期的傾向について何らかの法則性を見出すことができれば、それを用いて堆積物中の海産植物由来の環境DNAの濃度から同じ植物に由来する有機炭素の貯留量を算定することができるはずであるが、現段階では研究例が少ないためまだその見通しは立っていない。

終わりに

　海洋堆積物、特に生息地から離れた外洋域の堆積物中にブルーカーボン由来の有機炭素が長期的に貯留されていることを実証する目的で環境DNAの手法を応用する場合、設定した研究目的にかなう実証データが得られる確実性と検出感度の高さという観点からは、現在のところメタバーコーディング法よりもqPCR法の方が優れていると思われる。一方、メタバーコーディング法を用いると網羅的な植物種の検出ができること、特に事前に把握できていなかった植物種の存在まで検出できるというメリットがあるため、炭素貯留に貢献している植物種の種組成や生物多様性の評価が目的に含まれる場合はメタバーコーディング法の方に優位性がある。メタバーコーディング法では一度の分析から膨大なデータが出力されるため、直接の研究目的ではなかった事柄に関しても同じデータから様々な小さな発見をすることができるという楽しみもある。ブルーカーボン研究の分野における環境DNA技術の開発と応用は今後も奨励されるべきであるが、その実際の適用に当たっては、本稿を通して述べてきたような各手法に特有の数々の技術的弱点があることを十分に考慮した上で、研究計画を立て、得られた結果の解釈を行うべきである。

謝辞

　本稿の内容は以下の支援事業のもとで行われた研究の成果に基づいている：農林水産省委託プロジェクト研究（課題番号JPJ008722）、戦略的創造研究推進事業（JPMJCR23J1）、環境研究総合推進費（JPMEERF20224M01）。

（本稿は2025年3月に刊行された『月刊海洋』誌57巻4号に掲載されている宮島・浜口による総説に基づいている。既読の方にとっては新たな情報は特に含まれていないが、引用文献をリンクからたどるための利便性を考慮して再掲した。）

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最終更新日：2025年11月3日